质粒来源：Addgene # 21074 ( 载体pEGFP-C1+mRFP；插入基因 Rat LC3B，GenBank ID: U05784 )

背景：自噬为机体在亚细胞水平的“自我吞噬”，可以帮助细胞维持自身稳态及适应应激环境。近年来，自噬已成为生物学领域中的一个研究热点。迄今研究发现，自噬可以参与多种疾病的发生发展，例如肿瘤，心血管疾病，神经退行性疾病等。因而，自噬在各类相关疾病研究中作为药物筛选靶点越来越受关注和讨论。自噬研究的基础是地观察，定量细胞中自噬的发生。而目前应用广泛的自噬检测方法为观察GFP-LC3荧光斑，细胞正常生理环境LC3呈弥散状分布，自噬激活时LC3会转移自噬囊泡上，因此，GFP荧光的弥散或斑点状聚集可以比较的反应细胞状态。

由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。

优点：mRFP-EGFP-LC3稳转细胞株可以稳定持续的表达mRFP-EGFP-LC3，能够地解决瞬转实验的效率、周期长、操作繁琐、不稳定等问题，有利于实验结果稳定性与可重复性。

mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。

目前已经有的细胞系：

乳腺癌细胞MCF-7/mRFP-EGFP-LC3，

胰腺癌细胞BxPC3/ mRFP-EGFP-LC3

巨噬细胞RAW264.7 / mRFP-EGFP-LC3

参考文献：

1. Ogata, M., et al. Autophapy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress. Molecular and cellular biology26, 9220-9231 (2006).

2. Kimura, S., Noda, T. & Yoshimori, T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy3, 452-460 (2007).
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